Einleitung
Einführung in  
 Kompaktkameras
Technische Grundlagen
Vorteile der 
 Digitalfotografie
Schwarz-Weiss- 
 Digitalfotografie
Praktischer Einsatz  
 von Kompaktkameras
Erprobte Modelle
Bewertung von 
 Kompaktkameras
Einführung in  
 Spiegelreflexkameras
Vor- u. Nachteile v. 
 Spiegelreflexkameras
Adaptation von  
 Spiegelreflexkameras
Erprobung von  
 Spiegelreflexkameras
Bewertung von  
 Spiegelreflexkameras
Verwendung von  
 Elektronenblitzgeräten
Empfehlungen zur  
 Auswahl einer Kamera
Einführung in 
 Stacking-Software
Optische Steigerung 
 der Tiefenschärfe
Funktionsweise von 
 Stacking-Software
Erprobte Programme
Ergebnisse der  
 Software-Tests
Bewertung der  
 Stacking-Software
Einführung in  
 Astro-Filter
Getestete Astro-Filter
Ergebnisse  
 der Filtertests
Bewertung  
 der Astro-Filter
Einführung in  
 Ringartefakte
Beschreibung der 
 Ringartefakte
Physikalische Aspekte  
 von Ringartefakten
Schlussfolgerungen  
 über Ringartefakte
Großflächige Objekte
Literatur,  
 Quellennachweis
Eigene Publikationen 
 zur Mikroskopie
Links
Impressum, Kontakt
Ergebnisse der Software-Tests

Allgemeine Aspekte:

Ausgiebige Testungen der Software Combine Z 5 haben gezeigt, dass dieses Computerprogramm in allen Beleuchtungsarten und Vergrößerungsbereichen der lichtmikroskopischen Routine zur Verbesserung der Tiefenschärfe mit ausgezeichnetem Erfolg eingesetzt werden kann. Ein zusätzlicher Nutzaspekt ergibt sich aus der Möglichkeit, durch Überlagerung unterschiedlich exponierter Einzelaufnahmen einen allzu hohen Kontrastumfang aufgrund überhöhter Lichtgegensätze auszugleichen. Schließlich können auch einige Bildartefakte, beispielsweise Konturüberstrahlungen bei Dunkelfeldbeleuchtung reduziert oder beseitigt werden.

Die Shareware Helicon Focus führt als sehr brauchbare Alternative zu gleichwertigen Ergebnissen, welche unter Verwendung der herstellersteitigen Standardeinstellungen denjenigen Resultaten gleichen, die sich bei Verwendung von Combine Z 5 mit dem Macro-Befehl “Do Stack” erzielen lassen.

Die Freeware Picolay ist als alternativ oder ergänzend einsetzbare Software ebenfalls sehr attraktiv, da die verschiedenen Macros dieser Software die höchste Varianz an Informationsverarbeitung zeigen, so dass je nach Macro durchaus unterschiedlich akzentuierte Bildrekonstruktionen entstehen können.

Sofern ein Objekt bei Abbildung in einer Bildserie infolge einer nicht exakt lotgerechten Tubusausrichtung bei Änderung der Schärfenebene schrittweise in einer Richtung verschoben wird - dies ist bei bestimmten Montierungen im Bereich der Lupen- und Stereomikroskopie möglich -, kann Combine Z 5 solche Verschiebungen im automatischen Justierungsprozess zuverlässig und präzise ausgleichen. Die sonstigen Programme sind hingegen mit einer Korrektur solcher Verschiebungen meist überfordert.

 

Komponenten der Qualitätsverbesserung:

Werden die vorerwähnten Programme eingesetzt, tragen verschiedene Komponenten zur qualitativen Verbesserung des resultierenden Summationsbildes bei. Evident ist die fundamentale Steigerung der Tiefenschärfe.

Zusätzlich können Artefakte eliminiert oder verringert werden, wenn die Software diese bei der Bildrekonstruktion herausrechnet. Dies gilt beispielsweise für mögliche Rauschartefakte und Überstrahlungseffekte bei Dunkelfeldbeleuchtung. Bei Objekten mit sehr hohen Helligkeitskontrasten können ausgewogener belichtete Bilder mit verringerten über- oder unterbelichteten Anteilen realisiert werden, wenn eine Belichtungsreihe erstellt wird und die unterschiedlich belichteten Einzelaufnahmen anschließend überlagert werden.

Speziell bei hohen Vergrößerungen können Konturschärfe und Auflösung ggf. substanziell verbessert werden, wenn interessierende Details bei minimal variierender Fokussierung mehrmals fotografiert und die zugehörigen Einzelbilder anschließend überlagert werden. In diesem Fall können verbliebene punktuelle Restunschärfen seitens Software herausgerechnet werden. Auch physiologisch und technisch bedingte Einschränkungen der Fokussiergenauigkeit (Akkomodationsschwankungen des Auges, Restfehler bei der Justierung eines Fehlsichtigkeitsausgleiches, eingeschränkte Schärfe eines Monitors oder Kameradisplays etc.) können durch wiederholtes Fokussieren und Fotografieren mit anschließender Bildüberlagerung reduziert oder ausgeschaltet werden.

Die Vergrößerungsfähigkeit digitaler Aufnahmen wird grundsätzlich verbessert, da die Datendichte resultierender Summationsbilder auf Grund gesteigerter Bildinformation i.d.R. höher liegt als bei den Einzelaufnahmen der zugehörigen Bildsequenz. Je nach Informationsdichte des Objektes kann der Datenumfang des rekonstruierten Bildes auf das Zwei- bis Vierfache anwachsen.

 

Software-abhängige Einschränkungen:

Von anderen Autoren wurde diskutiert, dass ein Mikroskop einer Stereolupe vorgezogen werden sollte, da bei Stereolupen während der Erstellung einer Bildserie ein Bildversatz möglich ist, den nicht alle Programme korrigieren können (Günther, 2006). Im Hinblick auf Helicon Focus und Picolay kann dies auch nach eigener Erfahrung bestätigt werden. Combine Z 5 hingegen ist nach Maßgabe eigener Testungen sehr gut in der Lage, vorhandene Bildverschiebungen innerhalb einer Serie exakt zu korrigieren, so dass einwandfreie Rekonstruktionen möglich bleiben.

Weitere Einschränkungen können sich programmabhängig bei Verwendung von monochromatischem Licht ergeben. In diesem Fall kann Combine Z 5 mit der Konturerkennung überfordert sein, so dass die Bildüberlagerung programmseitig vorzeitig unter Fehlermeldungen abgebrochen wird. Helicon Focus und Picolay konnten hingegen alle getesteten monochromatischen Bilder ohne Probleme mit sehr guten Resultaten verarbeiten.

 

Bearbeitungsgeschwindigkeit

Auf programmabhängige Unterschiede der jeweiligen Verarbeitungszeiten wurde bereits von GÜNTHER hingewiesen. Werden Bildsequenzen mit verschiedenen Rechnern unter Einsatz unterschiedlicher Programme und Verwendung unterschiedlicher Macros vergleichend verarbeitet, können mehrere mathematische Gesetzmäßigkeiten abgeleitet werden. Wenn die Größe der Einzelbilder verdoppelt wird, verlängert sich die Verarbeitungszeit etwa auf das 2,0- bis 2,5-fache.

Die Bearbeitungszeit verhält sich proportional zur Anzahl der zu verarbeitenden Einzelbilder.

Das folgende Diagramm zeigt beispielhaft Messergebnisse für Helicon Focus und zwei Macros von Combine Z 5, jeweils bezogen auf Einzelbilder unterschiedlicher Größe (2027x1520 und 3072x2304 dpi). Es ist ersichtlich, dass die ungefähre Bearbeitungszeit für eine Bildserie in Sekunden abgeschätzt werden kann, wenn die Anzahl der zu verarbeitenden Einzelbilder je nach Software, Macro und Bildgröße mit dem 3- bis 20-fachen multipliziert wird.

Die Vergleichsmessungen wurden mit zwei unterschiedlichen Computern durchgeführt. Zur Verfügung stand ein PC mit Pentium III-1333-Prozessor und Windows 98 SE, ein weiterer mit Pentium IV-1994-Prozessor und Windows XP; beide Rechner waren mit 512 MB RAM bestückt. Die erhältlichen Messwerte waren für die getesteten Applikationen bei beiden Rechnern identisch.
 

Bearbeitungszeit in Sekunden (t) in Abhängigkeit von der Anzahl der Einzelbilder (N),
Vergleichsmessungen für Helicon Focus (Graph a-b) und Combine Z 5 (Graph 1-4)
(Identische Kurvenverläufe für P III-Prozessor, 1333 MHz, Win. 98 SE und
P IV-Prozessor, 1994 MHz, Win. XP)

  • Graph a: Einzelbilder 2048 X 1536, durchschnittliche Bildgröße: 2,2 MB,
    Standard-Presets, approximative Funktion: t = 3 N
  • Graph b: Einzelbilder 3072 X 2304, durchschnittliche Bildgröße: 3,9 MB,
    Standard-Presets, approximative Funktion: t = 7 N
  • Graph 1: Einzelbilder 2048 X 1536, durchschnittliche Bildgröße: 2,2 MB,
    Macro “Do Stack”, approximative Funktion: t = 4,5 N + 40
  • Graph 2: Einzelbilder 2048 X 1536, durchschnittliche Bildgröße: 2,2 MB,
    Macro “Do Average and Filter”, approximative Funktion: t = 7 N
  • Graph 3: Einzelbilder 3072 X 2304, durchschnittliche Bildgröße: 3,9 MB,
    Macro “Do Stack”, approximative Funktion: t = 8 N + 90
  • Graph 4: Einzelbilder 3072 X 2304, durchschnittliche Bildgröße: 3,9 MB,
    Macro “Do Average and Filter”, approximative Funktion: t = 20 N

 

Erweiterte Techniken

Die Qualität der erhältlichen 3D-Rekonstruktionen kann auf verschiedene Weise weitergehend verbessert werden.

 

Doppelte Bildüberlagerung (“Double stacking”):

Wenn Objekte mit besonders hoher Tiefenausdehnung zu fotografieren sind, kann das Rekonstruktionsergebnis ggf. Restunschärfen enthalten, auch wenn das Objekt lückenlos in zahlreichen Einzelbildern gescannt wurde. In diesem Fall kann die resultierende Bildschärfe weitergehend verbessert werden, wenn bei identischer Ansicht zwei separate Rekonstruktionen aus zwei separat erstellten Bildsequenzen durchgeführt werden. In einem zweiten Schritt können die beiden resultierenden Summationsbilder erneut überlagert werden. Das hieraus entstehende Rekonstruktionsbild zeigt meist eine nochmals sichtbar verbesserte Schärfe.

Bei Verwendung von Combine Z 5 kann das Rekonstruktionsbild einer Serie zweifach abgespeichert werden, und zwar als “Frame / Picture” und als “Rectangle”. Da diese beiden Speicheroptionen offenbar mit unterschiedlichen Algorithmen arbeiten, können die Schärfeebenen bei “Frame” und “Rectangle” leicht differieren. In solchen Fällen kann die Schärfe im Endergebnis ebenfalls sichtbar verbessert werden, wenn “Frame” und “Rectangle” in einem zweiten Schritt nochmals zu einem Summationsbild überlagert werden.

 

Bildüberlagerungen bei variabeler Farbtemperatur:

Bei bestimmten Objekten, z.B. ungefärbten vitalen Zellen im Phasenkontrast, können zusätzliche Farbkontraste zur Bildverbesserung beitragen, wenn von einem Objekt zwei Rekonstruktionsbilder bei unterschiedlicher Farbtemperatur erstellt werden, welche ihrerseits erneut überlagert werden, wie vorausgehend unter “Double stacking” beschrieben.

Zwei separate Bildsequenzen eines Objektes können beispielsweise bei Glühlampenlicht und Blitzlichtbeleuchtung angefertigt werden; diese Sequenzen und ihre Summationsbilder unterscheiden sich wesentlich in Farbtemperatur und Farbcharakteristik.

Werden die Summationsbilder beider Serien ihrerseits erneut überlagert, bewirken die Koinzidenzen von rot-gelbem Glühlampenlicht und blau-violettem Blitzlicht zusätzliche farbliche Kontrastierungseffekte, welche einer Solarisation ähneln. Auf diese Weise können feine Strukturen im submikroskopischen Grenzbereich, z.B. Membrantexturen des Zellrandes oder intrazelluläre Granulationen, deutlicher dargestellt werden.

 

Bildüberlagerungen in monochromatischem Licht

Wenn auf mehrfarbige Darstellungen verzichtet werden kann, gewährleistet monochromatisches Grünlicht (Wellenlänge: ca. 540 nm) aus technisch-physikalischen Gründen eine optimierte Bildschärfe. Potenzielle Restunschärfen auf Grund chromatischer Aberrationen im Bereich der Mikroskop- und Kameraoptik werden bei monochromatischer Beleuchtung vollständig eliminiert. Zusätzlich ergibt sich bei Digitalkameras im monochromatischen Grünlicht eine optimierte Auflösung und Konturschärfe, da die Pixel handelsüblicher Farbchips mehrheitlich auf Grünlicht ansprechen (50% Grünlicht, je 25% Rot- und Blaulicht). Auch die Diskriminationsfähigkeit des menschlichen Auges ist im Grünbereich maximiert. Weitere Einzelheiten zu diesen Gesetzmäßigkeiten sind anderweitig publiziert (Altmann, 2003).

Wenn von einem Objekt eine Bildsequenz in monochromatischem Grünlicht erstellt wird, kann das resultierende Summationsbild bei Vergleichsziehung zu konventioneller Weißlichtbeleuchtung von überlegener Qualität sein, so dass auch feine Strukturen im Grenzbereich der lichtmikroskopischen Darstellbarkeit sichtbar werden.

Der Kontrastumfang kann bei streng monochromatischer Beleuchtung im Vergleich zu Weißlicht herabgesetzt sein. Wahrscheinlich auf Grund dieser Gegebenheiten kann die Software Combine Z 5 monochromatische Bilder nach eigener Erfahrung nicht verarbeiten. Für monochromatische Bildrekonstruktionen muss daher auf andere Programme, z.B. Helicon Focus, zurückgegriffen werden. Die schärfeoptimierten monochromatischen Summationsbilder können mittels konventioneller Bildbearbeitungssoftware nach ihrer Fertigstellung im Kontrast nachträglich optimiert werden, vorzugsweise durch Veränderung der Gradationskurve bzw. des Gradationshistogramms.

Die folgenden Abbildungen zeigen exemplarisch das Verbesserungspotenzial von Überlagerungstechniken am Beispiel der beiden Programme Combine Z 5 und Helicon Focus. Die Dateigröße der einzelnen Bildtafeln liegt jeweils bei etwa 150 kB; die Bilder können daher bei Interesse auf auf den eigenen Rechner heruntergeladen und mit geeigneter Viewer-Software im Vollbildmodus betrachtet werden.


Seestern-Arm, Stereomikroskop, Auflicht, Objektiv 2x, Okular 10x, horizontale Feldweite: 4 mm,
konventionelle Einzelaufnahme links, Rekonstruktion aus 8 Einzelbildern rechts,
Software: Combine Z 5

 

Herzigel-Skelett, Stereomikroskop, Auflicht, Objektiv 4x, Okular 10x, horizontale Feldweite: 2 mm
konventionelle Einzelaufnahme links, Rekonstruktion aus 7 Einzelbildern rechts,
Software: Combine Z 5

 

Alaun-Kristalle, Dunkelfeld, Objektiv 10x, Okular 6,5x, horizontale Feldweite: 1,5 mm,
konventionelle Einzelaufnahme links, Rekonstruktion aus 4 Einzelbildern rechts,
Software: Combine Z 5

 

Mückenkopf, Dunkelfeld, Objektiv 10x, Okular 10x, horizontale Feldweite: 0,75 mm,
konventionelle Einzelaufnahme links, Rekonstruktion aus 8 Einzelbildern rechts,
Software: Combine Z 5

 

Grillenmagen, polarisiertes Licht mit Lambda-Viertel-Kompensator, Objektiv 40x, Okular 8x,
horizontale Feldweite: 0,15 mm,
konventionelle Einzelaufnahme links, Rekonstruktion aus 17 Einzelbildern rechts,
Software: Combine Z 5

 

Grillenmagen, polarisiertes Licht mit Lambda-Kompensator, Objektiv 40x, Okular 8x,
horizontale Feldweite: 0,15 mm,
konventionelle Einzelaufnahme links, Rekonstruktion aus 14 Einzelbildern rechts,
Software: Combine Z 5

 

Epithelzelle, Phasenkontrast, Objektiv Öl 100x, Okular 12,5x, horizontale Feldweite: 0,05 mm,
Links: Konventionelle Einzelaufnahme, Mitte: Rekonstruktionen aus 17 Einzelbildern,
Rechts: Überlagerung zweier Rekonstruktionen aus zwei separaten Bildserien (“Double-Stacking”),
erstellt in Glühlampen- und Biltzlichtbeleuchtung, intensivierter Farb-Doppelkontrast,
Software: Combine Z 5

 

Epithelzelle, Phasenkontrast, Objektiv Öl 100x, Okular 12,5x, horizontale Feldweite: 0,05 mm,
Optimierung der Abbildungsqualität durch Verwendung von monochromatischem Grünlicht,
Links: Konventionelle Einzelaufnahme links, Mitte: Rekonstruktionen aus 11 Einzelbildern,
Rechts: Umwandlung des monochromatischen Grünbildes in ein äquivalentes Schwarz-Weiß-Bild,
Software: Helicon Focus

 

Detailansichten aus obiger Epithelzelle, Phasenkontrast, Objektiv Öl 100x, Okular 12,5x,
horizontale Feldweite: ca. 0,01 mm,
Links und rechts: Subzelluläre Membrantexturen, Mitte: Zellkern,
Software: Helicon Focus

 Copyright: Jörg Piper, 2007